产品描述

　　兔子肿瘤坏死因子ɑ(TNF-ɑ)ELISA试剂盒

　　测定范围：3 pg/ml -800 pg/ml 96 次测定

　　目的

　　该试剂盒可用于测定兔血清、细胞培养上清液和其他生物液体中的 TNF-a 浓度

　　测定原理

　　本试剂盒测定样品中兔TNF-a水平，用纯化的兔TNF-a抗体包被微量滴定板孔，制成固相抗体，然后加入TNF-a毛巾，与HRP标记的TNF-a抗体结合，形成抗体-抗原-酶-抗体复合物，洗涤完全后，加入TMB底物溶液，TMB底物在HRP酶催化下呈蓝色，加入硫酸溶液终止反应，颜色变化为通过分光光度法在 450 nm 波长处测量。然后通过比较 O.D. 来确定样品中兔 TNF-a 的浓度。 将样品绘制成标准曲线。

　　标本要求

　　1.标本采集后尽快提取，并按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。 若不能，可将标本置于-20℃保存，避免反复冻融循环。

　　2.不能检测含有NaN3的样品，因为NaN3抑制HRP活性。

　　检测程序

　　1.稀释并添加样品：稀释原密度标准品如下表：800 pg/ml 5 标准品 150μl 原始密度标准品+150μl 标准品稀释液400 pg/ml 4 标准品 150μl 5 标准品+150μl 标准品稀释液200 pg/ml 3 标准品 150μl 4 标准品+150μl 标准品稀释液100 pg/ml 2 标准品 150μl 3 标准品 +150μl 标准品稀释液50 pg/ml 1 标准品 150μl 2 标准品 +150μl 标准品稀释液

　　2.添加样品：单独设置空白孔(空白对照孔不添加样品和HRP-Conjugate试剂，其他各步骤操作相同)。 测试样品良好。 将样品稀释液40μl加入待测样品孔中，然后加入待测样品10ul(样品最终稀释度为5倍)，将样品加入孔中，尽量不要接触孔壁，轻轻混匀。

　　3.孵育：用封闭板膜封闭板后，37℃孵育30分钟。

　　4.配置液：30倍(或20倍)洗涤液用蒸馏水稀释30倍(或20倍)备用。

　　5.洗涤：揭开封板膜，弃去液体，甩干，每孔加入洗涤缓冲液，静置30s后沥干，重复5次，拍干。

　　6.加酶：除空白孔外，每孔加HRP-Conjugate试剂50μl。

　　7.孵化：同3一起操作。

　　8.洗涤：操作同5。

　　9.显色：每孔加入显色液A 50ul、显色液B 50ul，37℃避光保存10min

　　10.终止反应：每孔加入终止液50μl，终止反应(蓝色变为黄色)。

　　11.测定：取空白孔置零，加入终止液后15min内在450nm处读取吸光度。

　　步骤说明

　　标准品、样品稀释液

　　加入标准品、样品稀释液，37℃孵育30分钟。洗涤5次，加入HRP-Conjugate试剂，37℃孵育30分钟。洗涤5次，加入显色剂A和B，37℃孵育10分钟。加入终止液15 分钟内读取 450nm 处的吸光度计算，以标准密度为横，OD值为纵，在方格纸上绘制标准曲线，根据样品OD值乘以稀释倍数，求出相应的密度，或用标准密度与OD值计算标准曲线的直线回归方程，方程中4个样品的OD值，计算出样品密度，乘以稀释倍数，结果即为样品的实际密度。

　　重要笔记

　　1. 试剂盒从冷藏环境中取出后应在室温下平衡15-30分钟，酶标板包被后如开封后未用完，应将板保存在密封袋中。

　　2. 洗涤缓冲液会结晶分离，稀释时可加热水帮助溶解。 洗涤不影响结果。

　　3. 用进样器添加样品的每一步，并经常校对其准确性，避免实验误差。 5分钟内添加样品，如果样品数量较多，建议使用Volley。

　　4. 如果检测物质含量过高(样品OD大于第一个标准孔)，请稀释样品(n倍)，请稀释并乘以稀释倍数(xn×5)。

　　5. 封板膜仅限制一次性使用，避免交叉污染。

　　6. 基材避光保存。

　　7. 请按照使用说明严格来说，检测结果的判定必须以酶标仪为标准。

　　8. 所有样品、洗涤缓冲液和各种剔除物均应按照感染性物质处理。

　　9. 请勿将试剂与其他批次的试剂混合。

　　储存及有效期

　　1、储存：2-8℃。

　　2.有效期：六个月